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探讨不同酸碱性条件下孵育对抗体表达的影响

2020-3-26 16:19| 发布者: admin| 查看: 161| 评论: 0|原作者: 湖州市妇幼保健院 赖世平 邓再兴 陈莉萍

摘要: 【摘要】目的探讨ER、PR、HER-2在室温、4 ℃冰箱中以及在-80 ℃蜡封保存的组织切片表达的变化。方法收集湖州妇幼保健院已行ER、PR、HER-2 免疫组化检测的浸润性乳腺癌,于三种不同条件下保存3年后重新行免疫组化检 ...

【摘要】目的  探讨ER、PR、HER-2在室温、4 ℃冰箱中以及在-80 ℃蜡封保存的组织切片表达的变化。方法  收集湖州妇幼保健院已行ER、PR、HER-2 免疫组化检测的浸润性乳腺癌,于三种不同条件下保存3年后重新行免疫组化检测。结果 ER、 PR和 HER-2 的 3+病例在-80 ℃保存的组织切片与原有的免疫组化结果在表达强度及表达范围几乎没有影响。ER、PR组织切片在室温下表达强度均明显降低,甚至出现信号消失的情况;而 HER-2 3+ 的片子在室温下表达强度虽然稍减弱。HER-2  2+ 及1+ 病例均出现信号消失。ER、 PR的 3+病例在4 ℃保存的组织切片与原有的免疫组化结果均稍减弱,但HER-2 3 + 病例表达强度无影响。ER、 PR和 HER-2 2+ 病例的表达均减弱,1+ 病例甚至出现信号消失。结论 保存组织应低温以及与空气隔离,避免组织与外界发生氧化反应,降低保存温度减少自身酶反应,可有效减少抗原丢失。

【关键词】 室温  4 ℃ -80 ℃  表达变化

【中图分类号】R730.3    【文献标识码】A

在病理科技术员的日常的工作中,经常要碰到对石蜡组织进行预切片,本文将研究这种操作在不同条件下对组织抗原性是否有影响,以及影响的程度。在一些临床工作中,为了减少组织浪费,尤其是一些微小病变,常常反复对组织进行切片,使病变组织损失较多。为尽可能保存病变组织,减少对组织的损耗,我们通常会对组织进行一次切片来获取多张空白切片;也可以通过制作组织芯片的方法来进行切片,技术员也习惯将组织芯片连续切片,贴好片后保存。本文通过观察三种不同条件下长期保存的乳腺癌石蜡切片ER、PR、HER-2的状态,探讨组织切片的最佳保存条件。


1 材料与方法

1.1 一般资料 收集湖州妇幼保健院已行ER、PR、HER-2 免疫组化检测的浸润性乳腺癌 42例,于三种不同条件下保存3年后重新行免疫组化检测。


1.2组织芯片 显微镜下观察 42 例乳腺浸润性癌的 HE 切片,确定乳腺癌浸润部分,每例选取 3 个位点进行标记;采用组织芯片仪在受体蜡块上打孔,将做好标记的蜡块上钻取的组织柱。组织芯片的特点是: 体积小, 信息含量大, 一次性实验即可获大量结果[1]。按设计方案将组织移到受体蜡块上。把设计好的蜡块放入 55 ℃烤箱,在半融状态下取出,室温冷却,放入 4 ℃冰箱中备用。将制作好的组织芯片蜡块连续4 μm 厚切片42张,贴在带正电荷玻片(Thermo SuperFrost Plus Slide)上,于 55 ℃过夜烤片。将 42 张组织芯片分成 3 组,每组 3 张切片分别保存于室温、4 ℃和蜡封 -80 ℃,保存3 年。


1.3 主要试剂

ER单克隆兔抗体(克隆号SPA),PR为单克隆兔抗体(克隆号为SP2), HER-2为单克隆(克隆号为SP3)均购自福建迈新公司。

1.4方法 三种抗体均选用免疫组化EnVision两步法进行染色。严格的按照二抗试剂盒说明书进行实验操作。采取抗体稀释液代替一抗作为阴性对照组,选取已知阳性样本作为阳性对照组,验证选取的一抗具有正确的定位和染色结果。


1.5结果判读 乳腺癌 HER-2 免疫组化结果判读标准[2]:CerbB-2 阳性表达以细胞膜及细胞浆出现棕黄色或黄色颗粒为准。在每个视野计数 200 个肿瘤细胞中的阳性细胞数,按阳性细胞数占总细胞数的比例计算阳性表达率。阳性表达判定标准为:染色无阳性细胞为( - );阳性细胞数 >60% 为( +++ ),阳性细胞数 <30% 为( + ),介于两者之间为( ++ )。乳腺癌 PR 与ER 免疫组化判读标准[3]:阳性表达时细胞核有棕黄色颗粒,在随意 5 个高倍镜视野下,平均阳性细胞比例:阳性细胞比例不足 10% 为阴性,超过 10% 为阳性,并根据阳性细胞比例分为+ (10% ~25%)、++ (26% ~ 50%)、+++ (超过 50%)。以上结果均由三位有经验的病理诊断医师共同判读。


2 结果   ER、 PR和 HER-2 的 3+病例在-80 ℃保存的组织切片与原有的免疫组化结果在表达强度及表达范围几乎没有影响。ER、 PR组织切片在室温下表达强度均明显降低,特别是 1 + 和 2 +的片子,甚至出现信号消失的情况;而 HER-2 3+ 的片子在室温下表达强度虽然稍减弱,但结果判读几乎不受影响,HER-2  2+ 及1+ 病例均出现信号消失。ER、 PR的 3+病例在4 ℃保存的组织切片与原有的免疫组化结果均稍减弱,但HER-2 3 + 病例表达强度无影响。ER、 PR和 HER-2 2+ 病例的表达均减弱,1+ 病例甚至出现信号消失。


表 1 不同条件下保存组织切片 3 年后乳腺癌 PR、ER免疫组化结果变化


表 2不同条件下保存组织切片 3 年后乳腺癌HER-2免疫组化结果变化


3  讨论

病理科目前首选固定液是 10% 的中性缓冲福尔马林,一般固定液的量为组织块体积的 4-10 倍,在常温条件下固定 8-24 h;为了保持组织细胞形态的完整性,最大限度地防止抗原的丢失,提高免疫组化的阳性率,在标本取材后,还应在 10% 中性缓冲福尔马林固定液中补固定 1-2 h。如果固定使用的 10% 福尔马林中没有加入缓冲盐调至中性,可能会降低免疫组化结果的阳性率,从而造成诊断误差[4]。而常温保存的组织切片随着时间的延长,容易受到环境的各种氧化作用,导致免疫组化检测出现假阴性结果[5]。本实验应用组织芯片对组织切片的保存条件进行分析研究,在相同的固定液及相同的PH值等实验条件下减少了实验误差[6]。通过3种的不同保存条件,探讨组织抗原受化学氧化、光氧化和热氧化等作用的影响。本实验通过室温保存的组织切片,除 HER-2 3 + 病例,其余标志物均出现阳性信号减弱甚至消失的现象。随着组织切片保存温度的降低,4℃条件下PR、ER 3 + 病例信号阳性信号稍减弱,但比室温阳性信号强,表明抗原存在氧化反应,使抗原丢失。HER-2 3 + 病例抗原阳性信号无变化,则表明该抗原保存较好。PR、ER,HER-2  2+以及1+阳性信号均明显减弱或消失,虽然保存温度已降低至 4 ℃,但组织在空气中仍然存在氧化作用,抗原丢失明显。蜡封 -80 ℃保存组织切片 PR、ER与 HER-2 病例信号均未变化,表明该条件下抗原保存完好。显然,与 HER-2 抗原相比较,PR、ER 抗原更易受温度的影响。本实验不仅观察了 PR、ER 和 HER-2 3 + 病例抗原的变化,还选择了 PR、ER 和 HER-2 1 + 及 2 + 病例进行讨论。经过 3 年时间,不管是室温还是 4 ℃条件下,组织切片的抗原性均有所破坏,甚至出现表达信号消失。组织切片暴露在空气中,虽然保存温度降低至 4 ℃,但仍然存在氧化作用。本实验在蜡封 - 80 ℃保存条件下,因蜡封后组织切片与空气隔绝并保持低温,PR、ER 和 HER-2 1 + 及 2 + 病例信号亦无明显减弱,抗原保存稳定。


综上所述,低温以及与空气隔离,避免组织与外界发生氧化反应,降低保存温度减少自身酶反应,可有效减少抗原丢失,因此在实验室条件允许的情况下,组织切片尽可能在隔绝外界氧化环境和低温条件下进行保存。


参考文献

[1]谈炎,李青.组织芯片技术的质量控制对肿瘤诊断准确性的研究[J].World Latest Medicine Information (Electronic Version),2017,1(17):52

2姜丽娜,刘薇,李江涛等.BRCA-1、BRCA-2和CerbB-2在不同时期乳腺癌组织中的差异性表达[J].中国现代普通外科进展,2018,21(6):471

3于喜法,秦合军.ER、PR、CerbB-2、p53和Ki-67在乳腺癌组织中的表达及其临床病理特征相关性[J].实用癌症杂志,2018,33(1):39.

4杨京平,张燕.钟延丰等固定液及抗原修复液PH值对免疫组化的影响[J].北京大学学报(医学版),2017,35(1):87

5林兴滔 ,葛岩,王慧玲等.不同条件下ER、PR、HER-2在乳腺癌中表达的变化[J].临床与实验病理学杂志.2019,35(2):232

6李文洁.影响免疫组织化学的因素及相关注意事项[J].世界最新医学信息文摘,2018,18(93):125


作者:湖州市妇幼保健院

赖世平 

邓再兴 

陈莉萍


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